Postęp technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i malejące koszty tych badań otworzyły nowe możliwości diagnostyki, szczególnie w przypadku rzadkich chorób. Co roku zgłaszanych jest około 250 nowych powiązań gen-choroba i ponad 9000 nowych powiązań wariant-choroba, co stale zwiększa naszą wiedzę na temat genomów.
Chociaż panele NGS są najczęściej stosowane klinicznie, rośnie również popularność sekwencjonowania całego eksomu (WES) i sekwencjonowania całego genomu (WGS). Niemniej jednak, szeroki zakres analiz nie zawsze oznacza, że WGS jest najlepszym podejściem NGS.
Przyjrzyjmy się charakterystyce i ograniczeniom różnych metod testowania genetycznego oraz podajmy kilka zaleceń.
Panele: Sekwencjonowanie Celowane
Panele, czyli sekwencjonowanie celowane, polegają na wybieraniu i analizie genów związanych z konkretną chorobą lub grupą chorób. Jest to najbardziej ekonomiczne i efektywne podejście diagnostyczne w przypadkach, gdy znane są już geny podejrzewanych chorób. Panele charakteryzują się większym pokryciem i większą głębokością sekwencjonowania wybranych genów, co ułatwia interpretację wyników.
Ze względu na niskie wskaźniki początkowej diagnozy rzadkich chorób, ważna jest ponowna analiza i reklasyfikacja. Badania wykazały, że znaczna część diagnoz rzadkich chorób obejmuje niedawno odkryte choroby: wśród pozytywnych wyników WES, 23% znajduje się w genach odkrytych w ciągu ostatnich dwóch lat, a 7% to nowe odkrycia genów. Jednak w większości przypadków sekwencjonowanie celowane umożliwia tylko jednorazową analizę. Oznacza to, że jeśli wynik panelu jest negatywny, nie można ponownie przeanalizować innych paneli.
Technologia sekwencjonowania nowej generacji (NGS) to zaawansowana technika sekwencjonowania DNA, która umożliwia równoczesne sekwencjonowanie milionów fragmentów DNA. NGS jest szybsze, bardziej wydajne i tańsze niż tradycyjne metody sekwencjonowania, co czyni je idealnym narzędziem do badań genomowych na dużą skalę. Stosuje się ją zarówno w badaniach naukowych, jak i klinicznych, w tym do diagnostyki rzadkich chorób, analiz genetycznych i badań nad nowotworami.
Sekwencjonowanie Całego Eksomu (WES)
Sekwencjonowanie całego eksomu (WES) to technika genetyczna, która polega na sekwencjonowaniu wszystkich regionów kodujących białka (eksomów) w genomie. Eksomy stanowią tylko około 2% ludzkiego genomu, ale zawierają około 85% patogennych wariantów genetycznych. WES jest używane głównie do identyfikacji mutacji odpowiedzialnych za różne choroby genetyczne, co czyni je wartościowym narzędziem w diagnostyce medycznej.
Regiony egzomowe stanowią tylko 2% ludzkiego genomu, ale obejmują około 85% patogennych wariantów. W niektórych przypadkach WES może być bardziej efektywne czasowo i kosztowo w porównaniu do paneli genetycznych i może dostarczyć bardziej rozbudowanych informacji genetycznych niż sekwencjonowanie celowane.
Jednak WES ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, nie wszystkie regiony egzomowe mogą być ocenione, a regiony niekodujące nie są sekwencjonowane, co uniemożliwia wykrycie funkcjonalnych wariantów. Ponadto, z wyjątkiem kilku zmian liczby kopii (CNV), w tym indeli i duplikacji, WES wykazuje niską czułość na strukturalne warianty (SV).
Dodatkowo wyniki mogą się różnić w zależności od analizowanego obiektu, nawet jeśli analiza jest przeprowadzana przy użyciu tej samej metody WES. Regiony docelowe i metody produkcji sond różnią się w zależności od typu użytego zestawu testowego, co skutkuje różną jakością danych. Średnio, ~100 000 mutacji można zidentyfikować z danych WES, które mogą być interpretowane różnie według wytycznych American College of Genetics and Genomics (ACMG), które priorytetowo traktują mutacje najbardziej związane z objawami.
Ze względu na te ograniczenia, mogą być wymagane dodatkowe testy. Niemniej jednak, ponieważ WES wymaga mniej odczynników sekwencjonujących niż WGS, jest zalecane jako test pierwszego wyboru w niektórych przypadkach, takich jak te z szczególnie ciężkimi objawami w okresie noworodkowym lub dzieciństwie, rozległymi, złożonymi i niespecyficznymi objawami; podejrzewane nierównowagi chromosomowe, zespoły mikrodelecji lub mikroduplikacji; oraz patogenne mutacje, które nie mogły być wykryte za pomocą wcześniejszych testów genetycznych.
Sekwencjonowanie Całego Genomu (WGS)
Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) to metoda, która analizuje cały genom organizmu, obejmując zarówno regiony kodujące, jak i niekodujące DNA. WGS dostarcza najbardziej kompleksowej informacji genetycznej, pozwalając na identyfikację wszystkich typów wariantów genetycznych, w tym mutacji w regionach niekodujących, strukturalnych wariantów i mutacji mitochondrialnych. Dzięki temu WGS ma najwyższy wskaźnik diagnostyczny w porównaniu do innych metod.
WGS obejmuje analizę całego genomu, dlatego jego wskaźnik diagnozy jest najwyższy spośród wszystkich metod testowania genetycznego. Oznacza to, że zastosowanie tej metody jako analizy pierwszego rzędu rozszerzy pokrycie analizy genowej na regiony niekodujące, zmniejszając tym samym potrzebę powtarzania testów. Ponadto metoda ta pozwala na wykrywanie wariantów, takich jak CV i DNA mitochondrialne, które nie mogą być oceniane za pomocą WES.
Jednak WGS ma również pewne ograniczenia. W porównaniu do WES, WGS generuje ogromne ilości danych, a koszt przechowywania i analizy tych danych jest dwa do trzech razy wyższy niż w przypadku WES, chociaż stałe postępy technologiczne stopniowo obniżają te koszty. Ponadto istnieje niewystarczająca ilość badań nad regionami niekodującymi w porównaniu z regionami egzomowymi, co skutkuje niedostatecznymi informacjami do analizy wariantów; ten brak dowodów dotyczących patogenności może prowadzić do zamieszania wśród genetyków klinicznych.
Grafika ukazuje zakres sekwencjonowanych par zasad w każdej metodzie:
Sekwencjonowanie Całego Genomu (WGS) obejmuje około 3 miliardy par zasad, czyli 100% ludzkiego genomu.
Sekwencjonowanie Całego Eksomu (WES) obejmuje około 60 milionów par zasad, czyli około 2% ludzkiego genomu.
Badanie jedno genowe obejmuje około 1000 par zasad, czyli około 0,000033% ludzkiego genomu.
Najlepsze podejście NGS
Średnio, diagnostyczna odysea pacjentów z rzadkimi chorobami trwa 7 lat. Biorąc pod uwagę, że 80% rzadkich chorób jest związanych z czynnikami genetycznymi, rozwój NGS przyczyni się do szybszej diagnozy. Obecnie, ze względu na szeroki zakres objawów WGS, przewidywanie niektórych rzadkich chorób przy użyciu tej metody jest trudne, choć może się to zmienić wraz z dalszym rozwojem technologii. W związku z tym WGS jest zalecane tylko wtedy, gdy patogenne warianty nie są wykrywane za pomocą sekwencjonowania celowanego lub WES.
Średnio wykrywa się 3 miliony mutacji za pomocą WGS, co sprawia, że niemal niemożliwe jest indywidualne określenie patogenności każdej mutacji. W związku z tym kilka grup badawczych, w tym 3billion, rozwija algorytmy i technologie sztucznej inteligencji (AI), aby zawęzić tę lukę. Model AI 3billion, 3Cnet, wykazał wysoką wydajność w przewidywaniu patogenności wariantów na podstawie danych klinicznych uzyskanych z ClinVar i zajął pierwsze miejsce w 6. Critical Assessment of Genome Interpretation.
Aby wybrać najbardziej odpowiednie NGS dla każdego pacjenta, klinicyści muszą kompleksowo rozważyć etap diagnostyczny, objawy, wiek, historię medyczną i rodzinną oraz sytuację ekonomiczną pacjenta. Wytyczne pochodzące z wiarygodnych instytucji publicznych, nowo opublikowane badania i doświadczenia kliniczne powinny stanowić podstawę do określenia odpowiedniej metody testów genetycznych. W 2021 roku ACMG zdecydowanie zaleciło WES i WGS jako testy pierwszego lub drugiego rzędu dla pacjentów z rzadkimi chorobami genetycznymi oraz wrodzonymi wadami rozwojowymi, opóźnieniami rozwojowymi lub niepełnosprawnością intelektualną (CA/DD/ID). Ponieważ niektóre badania wykazały, że WES i WGS mogą dostarczyć mocnych dowodów na zwiększenie wskaźników diagnozy i użyteczności klinicznej w tym konkretnym przypadku, mamy nadzieję, że nasza oferta badań WES i WGS mogą pomóc w diagnozowaniu rzadkich chorób u większej liczby pacjentów.
Przykłady sukcesów WES i WGS
Wielokrotnie zdarzało się, że dopiero badanie WES lub WGS wykryło przyczynę choroby genetycznej, której nie udało się zidentyfikować innymi metodami. Na przykład:
- Zespół Kabuki: Wykryty dopiero dzięki WES u pacjenta z niespecyficznymi objawami, które wcześniej nie mogły być wyjaśnione przez panele genetyczne.
- Zespół de Vries: WGS pomogło w identyfikacji rzadkiej mutacji, która była niewidoczna w standardowych testach, prowadząc do prawidłowej diagnozy i odpowiedniego leczenia.
- Mitochondrialne choroby: WGS wykryło mutacje w DNA mitochondrialnym, co pozwoliło na diagnozę i leczenie pacjentów z niewyjaśnionymi problemami neurologicznymi.
Rozwój technologii NGS otwiera nowe możliwości diagnostyczne, zwiększając szanse na szybkie i dokładne rozpoznanie rzadkich chorób genetycznych.